果实不仅是植物繁衍后代的重要方式，也是现代健康饮食的重要组成部分。自然界果实类型丰富多样，这些多样性既来源于丰富的果实类型（如干果和肉质果实），也来源于其风味、色泽和质地的不同。果实的风味品质主要在果实发育后期成熟过程中形成。成熟是肉质果实的典型生理过程，包括果实的软化、淀粉向糖的转化、色素的积累、挥发性香气物质的释放以及营养物质的生物合成等。

Fig.1 生物学问题的提出

（i）尽管果实颜色和香气大大不同，但它们大都经历了相似的成熟过程，说明在这个过程中不同类型的果实中存在着保守的调控机制。这种相似的保守调控机制是由什么引起的呢？

（ii）虽然不同类型的果实具有相似的成熟过程。然而，每种果实在成熟后期形成的风味物质都各具特色。这种多样性又是怎样形成的呢？

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）作为热带及亚热带的水果，以其独特的风味和营养价值而深受广大消费者的喜爱。荔枝的果实是由上位子房发育形成的真果，果肉是由胚珠的外珠被发育而成的假种皮。

根据多篇文献报道，荔枝果实香气主要来源于其所含萜类芳香物质种类和数量的不同。萜类合成酶（TPS）是萜类芳香物质生物合成中至关重要的末端酶，直接决定着萜类芳香物质的结构和种类。

虽然萜类芳香物质在模式植物和非模式植物中都得到了广泛的研究，但木本树种中萜类合成酶基因的鉴定却很有限。近年来，随着荔枝、龙眼等果树的高质量基因组的解析，多年生木本果树关于TPS基因的研究即将进入快速发展的阶段。

（1）LcNAC1是荔枝果实成熟过程中保守的调节因子

水果的成熟是一个复杂的过程，伴随着香气、颜色、质地和味道的改变。在这个过程中，许多生物因素共同地决定着果实的成熟。了解基因如何控制果实成熟是生物学中的一个突出问题。因此，为了研究荔枝果实成熟过程中主要表达的调控基因，本研究选择了早熟品种‘褐毛荔’荔枝从开花到果实成熟的十个时间点进行转录组测序和全面的RNA-seq分析（Fig.2a）。

其次，利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）确定了14个共表达模块（Fig. 2b）。值得注意的是，M2中的基因在荔枝假种皮发育后期（66 DAP-80 DAP）特异性高表达（Fig. 2b），并在该模块中鉴定到了一个关键的NAC转录因子，LcNAC1。随后，本研究发现LcNAC1基因的同源基因在多个物种的演化过程中具有一定的保守性（Fig. 2d）。

通过对M2中具有NAC结合基序模型的504个基因进行KEGG富集分析（Fig. 2e），发现有5个基因参与“倍半萜和三萜生物合成”途径，其中Lc01g020180（LcTPSa1）、Lc01g020190（LcTPSa2）和Lc01g020200（LcTPSa3）基因在3个荔枝品种的果实成熟过程中都具有显著高的转录水平，尤其是LcTPSa2。虽然荔枝果实香气是一种重要的园艺性状，但影响其香气合成的萜类合成酶及相关转录因子的遗传和分子机制鲜有报道。

Fig.2 LcNAC1在荔枝果实成熟过程中具有关键的调节作用

（2）转录因子LcNAC1调控并激活萜类合成酶LcTPSa1和LcTPSa2的表达

为了探究LcNAC1与其下游靶基因的调控关系，本研究通过酵母单杂交、凝胶阻滞实验以及双荧光素酶报告酶实验证实，LcNAC1能够调控并激活LcTPSa1和LcTPSa2的表达（Fig. 3f），而LcTPSa3基因的表达并非由LcNAC1直接调控，可能还受到其他转录因子的调控，这需要进一步的探究。

Fig.3 LcNAC1作为转录激活因子调节LcTPSa1和LcTPSa2的表达

（3）TPS基因簇内存在丰富的基因组变异导致倍半萜类物质合成的差异

在‘褐毛荔’荔枝基因组中，本研究发现LcTPSa1-LcTPSa3基因附近还存在1个LcTPSa4基因，这4个串联复制的基因（LcTPSa1-LcTPSa4）共同形成了一个倍半萜合酶基因簇。然而，转录组数据显示，LcTPSa4基因在早晚熟荔枝品种间均无表达量。

此外，值得注意的是，串联重复衍生的LcTPSa1基因在一些荔枝参考基因组中缺失，如‘怀枝’、‘糯米糍’荔枝等。同时，LcTPSa1基因在部分荔枝品种的单倍型间也存在缺失变异。为了验证LcTPSa1基因的存在缺失变异是否会影响TPS基因簇的总体表达量，本研究收集了37种不同品种的成熟期荔枝果实进行了实时荧光定量PCR的检测，发现来自同一基因簇的拷贝数变异对基因的表达有突出的贡献。

对关键TPS基因的编码区序列分析发现，与LcTPSa2和LcTPSa3相比，来自‘妃子笑’荔枝的LcTPSa1基因在第7外显子上有1 bp的缺失，这导致其ORF产生了一个过早终止密码子。分子对接结果显示，由于LcTPSa1的过早终止，使得LcTPSa1中的两个关键的氨基酸活性位点缺失，这可能会影响其与底物FPP的结合亲和力（Fig. 4）。因此，本研究选择LcTPSa1（存在序列差异）和LcTPSa2（表达量最高）作为功能验证的候选基因。

Fig.4 LcTPSa1和LcTPSa2差异蛋白序列分析、同源建模和分子对接分析

为了进一步剖析果实香气性状形成过程中功能基因启动子的潜在调控变异，本研究选择了表达量最高的LcTPSa2基因进行分析，发现了一个位于LcNAC1蛋白结合基序内的多态性位点，该位点在24种不同的荔枝单倍型中广泛存在。可以依次记为以下3种：G-type, A-type以及InDel（Fig. 5a）。那么，这里的SNP是否可以影响到LcNAC1蛋白的结合能力呢？通过EMSA实验发现，A-type结合基序显示出比G-type更弱的结合带。这一结果表明，LcTPSa2启动子中的SNP会影响LcNAC1蛋白结合的亲和力，这可能会影响荔枝品种间倍半萜生物合成的差异。

Fig.5 LcTPSa2启动子中的多态性位点分析

本研究提出了一个由TPS基因簇中存在的多种遗传变异引起的香气多样性的模型。以荔枝为例，荔枝果实的成熟过程类似于一条河流，其中河流的主流象征着控制果实成熟过程的核心枢纽LcNAC1。河流主流流向支流的分支代表着TPS基因簇内丰富的遗传变异，包括CNV、PAV、InDel和SNP，这些变异有助于荔枝香气多样性的形成，犹如支流下游更细小的分流一样（Fig. 6）。

Fig.6 TPS基因簇中丰富的自然变异促进荔枝果实香气多样性形成的模式图

本论文以华南农业大学为第一完成单位，博士研究生胡慧敏和刘鸿森为第一作者，郝彦伟副研究员和夏瑞教授为共同通讯作者。园艺学院曾灶海老师、硕士研究生萧亚轩、博士研究生麦迎晓、广西大学的张艳青老师和加州大学戴维斯分校的Blake C. Meyers教授也参与了论文的实验设计和讨论。本篇文章作者感谢上海交通大学刘振华老师慷慨赠予改造的pEAQ-HT-DEST-1载体质粒，同时也感谢华南农业大学测试中心郑茵老师在实验方面给予的耐心指导。此外，该研究得到了广东省重点领域研发计划（2022B0202070003），以及国家自然科学基金项目（#32072547，#332772665）的资助。